Bioprinting basato su estrusione UV-Assisted per realizzare gel idrogel GelMA per l’ingegneria dei tessuti molli da Singapore

È difficile produrre complessi costrutti di tessuto con le proprietà meccaniche necessarie e l’integrità della struttura quando si utilizza la bioprinting nell’ingegneria dei tessuti molli. Tipicamente, gli scienziati useranno materiali, come PCL, per rinforzare l’interno dei costrutti di bioprinting in 3D, ma il lungo periodo di degradazione non è grande. Ma un team di ricercatori – Pei Zhuang, Wei Long Ng, Jia An, Chee Kai Chua e Lay Poh Tan – dell’università tecnologica di Nanyang di Singapore hanno proposto un nuovo metodo di bioprinting in 3D con tecnologia UV basata su estrusione (UAE) che potrebbe aiutare fabbricare costrutti di tessuti molli con l’integrità strutturale desiderata. Il team espone il proprio lavoro in un documento intitolato “Bioprinting a base di estrusione a base di ultravioletti (UAE) strato-a-strati di costrutti idrogel con elevato rapporto di aspetto per applicazioni di ingegneria dei tessuti molli . “

L’abstract dice: “Qui presentiamo una facile strategia di bioprinting che combina la rapida tecnica di bioprinting basata sull’estrusione con un sistema di polimerizzazione ultravioletto (UV) integrato per facilitare la polimerizzazione UV strato per strato di GelMA foto-polimerizzabile idrogel a base di carbonio per ottenere costrutti carichi morbidi ma stabili con elevato rapporto di aspetto per l’ingegneria dei tessuti molli. GelMA è integrato con un potenziatore della viscosità (gomma gellan) per migliorare la stampabilità del bio-inchiostro e la fedeltà della forma, mantenendo la biocompatibilità prima della reticolazione tramite un processo di polimerizzazione UV strato per strato. Questo approccio potrebbe alla fine fabbricare costrutti di tessuti molli con proporzioni elevate (lunghezza a diametro) di ≥ 5. Sono stati anche studiati gli effetti della sorgente UV sulla risoluzione di stampa e sulla vitalità cellulare. Come prova di concetto, piccole unità di costruzione (reticolo 3D e costrutti tubolari) con proporzioni elevate sono fabbricate. Inoltre, abbiamo anche dimostrato la capacità di eseguire la stampa multi-materiale di costrutti di tessuto con proporzioni elevate lungo entrambe le direzioni longitudinale e trasversale per potenziali applicazioni nell’ingegneria tissutale dei tessuti molli. “

Disegno schematico della strategia di bioprinting assistita da strato per strato. La pistola gellam nel bioinchiostro funge da potenziatore della viscosità per migliorare la stampabilità del bio-inchiostro (attraverso la formazione di legami ionici tra la catena GelMA e la gomma gellan) durante il processo di estrusione prima di ulteriore reticolazione UV (per formare un legame chimico tra Catene GelMA) di ogni singolo strato stampato. Questa strategia di bioprinting assistita da strato dopo strato viene ripetuta per ottenere infine la fabbricazione di strutture 3D complesse con proporzioni elevate.

L’uso della biostampa 3D per depositare con precisione cellule e biomateriali può davvero aiutare a facilitare le interazioni tra loro, il che consente la maturazione dei tessuti. Un buon microambiente è necessario per la regolazione, ma come accennato in precedenza, quando si tratta di ingegneria dei tessuti molli, è difficile ottenerlo. Mentre ci sono molti approcci di bioprinting, l’estrusione-based sembra la migliore per la sua compatibilità con bioink, facilità d’uso e velocità di fabbricazione rapida.

“Un bio-inchiostro ideale dovrebbe presentare una buona stampabilità, biocompatibilità e rigidità del tessuto conforme”, hanno spiegato i ricercatori. “La maggior parte degli inchiostri bio esistenti viene modificata da biomateriali naturali come gelatina ([ 30 – 34 ]) e collagene ([ 35 – 37 ]) per formare nuovi bioinchiostri compositi con proprietà sintonizzabili. In particolare, la gelatina metacrilile (GelMA) è stata identificata come un promettente bio-inchiostro grazie alle sue eccellenti proprietà biologiche e alle proprietà fisiche sintonizzabili ([ 38 , 39 ]). “

La fase di bioprinting prevede la caratterizzazione delle proprietà reologiche, la determinazione della velocità di scansione UV adeguata e la selezione di bioinchiostri adatti.
A) Le proprietà reologiche di 30 diversi bioinchiostri GelMA-GG a una velocità di taglio costante di 100s-1 a 25 ° C indicavano una maggiore viscosità di bioinchiostro con crescenti concentrazioni di polimero. B) Una panoramica dei diversi bioinchiostri GelMA-GG in termini di stampabilità e incapsulamento cellulare. C) Immagini rappresentative di costrutti stampati per distinguere tra le tre diverse classificazioni; (In alto) scarsa stampabilità, buona (media) buona stampabilità, (inferiore) eccessiva gelificazione. D) Influenza del bioinchiostro sulla risoluzione di stampa, un bioinchiostro più viscoso risulta in una maggiore risoluzione di stampa a causa della riduzione significativa della diffusione dei bioinchiostri che si assottigliano durante il contatto con la superficie del substrato.

I bioink basati su GelMA sono spesso usati nella medicina rigenerativa e nell’ingegneria tissutale, ma se vi sono concentrazioni elevate di questo materiale, si può verificare un’attività cellulare limitata a causa della elevata densità di reticolazione e della rigidità dei costrutti fotoreticolati; basse concentrazioni possono causare scarsa fedeltà della forma e bassa risoluzione di stampa.

“Pertanto, è necessaria un’ulteriore ottimizzazione per migliorare la stabilità e la stampabilità dei bio-inchiostri GelMA. Sono stati esplorati una pletora di metodi per migliorare il comportamento reologico di GelMA, come l’aggiunta di vari materiali come i nanosilicati ([ 46 ]), il cross-linking GelMA con enzimi ([ 33 ]) o il processo di raffreddamento “, hanno affermato i ricercatori . “Tra questi metodi, la gomma gellan, che è un polisaccaride non tossico, è stata scoperta come promettente modificatore reologico per migliorare la proprietà reologica del bioinchiostro”.

Il team ha scelto di utilizzare la quantità minima necessaria di gomma gellan (GG) al fine di bilanciare la biocompatibilità e “dotare la stampabilità migliorata di GelMA-GG”, mentre utilizzavano la bioprinting UAE strato per strato nella costruzione di tessuti spessi carichi di cellule al fine di rafforzare la risoluzione e la stabilità della struttura.

“Come tale, abbiamo dimostrato la capacità di fabbricare costrutti bioprinti con proporzioni elevate attraverso una strategia di bioprinting UAE strato per strato”, hanno spiegato i ricercatori.

“Lo studio offre una nuova strategia di bioprinting per generare strutture 3D stabili con proprietà meccaniche conformi e un elevato rapporto di aspetto utilizzando bio-inchiostri basati su GelMA-GG per l’ingegneria dei costrutti di tessuti molli.”

Hanno studiato 30 diverse combinazioni di bio-inchiostri GelMA-GG in tre fasi:

Fase di preparazione Bioink
Fase di Bioprinting
Fase di post-stampa

A) A sinistra: struttura della griglia stampata senza polimerizzazione UV strato per strato utilizzando il gruppo 7.5-0.2. A destra: schema a griglia stampato con i 6 bio-inchiostri GelMA-GG selezionati. B) a. Costruzione di griglia stampata. b. Vista laterale del costrutto stampato. ce. Strutture tubolari stampate con bio-inchiostro GelMA-GG (7.5-0.2) con diversa AR, che è bioprintabile e permissiva alle cellule. fh. Deposito di più materiali con indurimento UV strato per strato.

Il team ha caricato le cellule nei bioink compositi per valutare la loro potenziale sedimentazione e la facilità di incapsulamento cellulare. I bioink sono stati quindi stampati utilizzando il metodo UAE per valutare l’accuratezza e la stampabilità dei costrutti. I ricercatori hanno adattato i parametri di stampa per “ottenere strutture con proporzioni elevate”, quindi hanno studiato gli “effetti UV sulla risoluzione di stampa e sul comportamento delle cellule”, prima di valutare definitivamente i costrutti stampati in 3D per il loro comportamento cellulare e le proprietà dei materiali corrispondenti.

Il team ha utilizzato un bioprinter regenHU , con una temperatura di 25 ± 1 ° C e ago 27G, per i suoi esperimenti e costrutti costruttivi GelMA-GG in una forma rettangolare.

“Per ottimizzare il processo di stampa, sono state stampate per la prima volta le strutture 2D per determinare la stampabilità del bioinchiostro e sono stati condotti ulteriori test per determinare la pressione di stampa e la velocità di alimentazione ottimali. Inoltre, la velocità di scansione UV ha mostrato effetti critici sulla risoluzione di stampa e sulla vitalità cellulare “, hanno scritto i ricercatori. “Per studiare l’influenza della velocità di scansione UV sulla risoluzione di stampa, i costrutti GelMA-GG incapsulati C2C12 con 1, 3, 5, 7, 9 e 11 strati sono stati stampati a griglia in base a velocità e pressione di stampa fisse. La larghezza dei filamenti stampati è stata misurata per determinare il cambiamento della risoluzione di stampa straordinario. Nel frattempo, la colorazione Live / dead e ImageJ sono state utilizzate per analizzare la vitalità cellulare nei costrutti stampati. Le cellule nello strato inferiore dei costrutti sono state riprese dal microscopio a fluorescenza per determinare l’influenza UV sulla vitalità cellulare mediante l’analisi del conteggio delle cellule. Dopodiché, la griglia 3D e i costrutti tubolari di differenti proporzioni a diametro variabile sono stati stampati con un approccio di polimerizzazione UV strato per strato utilizzando i parametri di stampa ottimali identificati con tutti i bio-inchiostri stampabili. “

Studio della vitalità e della proliferazione delle cellule C2C12 sulla stampa cellulare nei giorni 1,4 e 7; la barra della scala è 500 μm.

Sono state stampate anche celle C2C12, in modo che il team potesse studiare in che modo la rigidità del materiale e la microstruttura hanno influenzato il comportamento delle cellule. Sono stati in grado di scegliere facilmente bioinchiostri compositi per specifiche applicazioni di ingegneria tissutale eseguendo un approccio di fusione manuale.

“I bioinchiostri basati su GelMA hanno mostrato una grande biocompatibilità per le cellule a causa della presenza di peptidi RGD”, hanno concluso i ricercatori.

“Per trovare un equilibrio tra stampabilità e biocompatibilità, è stata aggiunta una quantità minima ideale di gomma gellan per far rispettare la stampabilità dei bioinks senza compromettere la biocompatibilità. Sono stati eseguiti la caratterizzazione e la valutazione approfondita dei diversi bioinchiostri compositi GelMA-GG per selezionare una gamma adeguata di bio-inchiostri GelMA-GG attraverso il nostro studio parametrico proposto.

“Dal nostro lavoro, è stata trovata una gamma adatta di viscosità di bioinchiostro inferiore a 0,124 Pa · s a 37 ° C, adatta per l’incapsulamento di cellule e per ottenere un bio-inchiostro omogeneo carico di cellule. La viscosità del materiale di 0,2-1,0 Pa · s ad una temperatura di stampa di 25 ° C è raccomandata per la stampa di complessi complessi 3D a celle con elevato rapporto di aspetto usando la nostra strategia di bioprinting assistita da strato su strato. È stato studiato il ruolo fondamentale della sorgente UV nel processo di stampa, in particolare l’influenza UV sulla risoluzione di stampa e il tasso di sopravvivenza cellulare. Inoltre, una forte correlazione tra microstruttura del materiale e rigidità è stata dimostrata nel nostro studio e la loro influenza sinergica sul comportamento delle cellule è stata studiata. “

I ricercatori hanno affermato che il loro metodo potrebbe essere adattato a tutti i materiali fotopolimerizzabili.

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